Oddelenie molekulárnej biológie a biotechnológií

Vedúca oddelenia: Ing. Jana Libantová, CSc.

tl_files/images/Drosera_rotundifolia_leaf.jpg
Pracovníci:

Ing. Eva Boszorádová, PhD.
Ing. Martin Jopčík, PhD.
RNDr. Radoslava Matúšová, PhD.
doc. Ing. Jana Moravčíková, PhD.

Doktorandi:
Ing. Monika Frátriková
Ing. Miroslav Rajninec

Odborní zamestnanci:
Anna Fábelová


Výskumná činnosť oddelenia Molekulárnej biológie a biotechnológií je zameraná na štúdium génov a ich regulačných oblastí s cieľom zvýšiť odolnosť agronomicky významných plodín voči stresovým faktorom. Výskum pokrýva dve základné oblasti:
(1) identifikáciu a izoláciu génov, ktoré zohrávajú úlohu počas biotického resp. abiotického stresu a testovanie účinku ich nadprodukcie po zavedení do transgénneho organizmu;
(2) moduláciu expresie transgénov v rastlinách tak, aby boli bezpečnejšie pre životné prostredie a akceptovateľnejšie pre spotrebiteľa.

Prvá oblasť pokrýva problematiku vplyvu abiotických faktorov (ťažkých kovov a sucha, nadmerného množstva dusíka v pôde) na obranné mechanizmy vybraných odrôd sóje fazuľovej (Glycine max L.), respektíve pšenice (Triticum aestivum L.). Doposiaľ dosiahnuté výsledky ukázali, že SSR markery je možno využiť ako lacnú a rýchlu skríningovú metódu, vhodnú na detekciu odrôd so zvýšeným potenciálom akumulovať ťažké kovy. Analýzy typických obranných proteínov stresu - chitináz sa vyznačujú kvantitatívnymi a kvalitatívnymi rozdielmi vo svojom profile v závislosti od typu kovu, resp. odrody. Izoformy chitináz identifikované ako responzívne na stres kovmi predstavujú potenciál pre biotechnologické programy z hľadiska prípravy transgénnych rastlín pre fytoremediačné účely.

tl_files/images/Obr1_JL.JPG
(A) Ukážka proteínových spektier rastlín a spektra enzýmov s chitinolytickou aktivitou
(B) Graf znázorňujúci kvantitatívne rozdiely špecifických chitináz po vystavení rastlín účinku ťažkých kovov

V rámci problematiky biotického stresu sa zameriavame na izoláciu a charakteristiku génov kódujúcich hydrolytické enzýmy, ktoré po zavedení do cieľového organizmu majú predpoklad zvýšiť obranyschopnosť rastliny voči patogénom. Ako jeden z génových zdrojov využívame mäsožravú rastlinu Drosera rotundifolia L. Predmetom výskumu sú gény zúčastňujúce sa tráviacich procesov rastliny, ktoré po prenose do modelového rastlinného organizmu pomocou metód génového inžinierstva testujeme, či podporia obranyschopnosť recipientných rastlín.

tl_files/images/Obr2_JL.JPG
(A) Izolácia génu pre hydrolytický enzým z D. rotundifolia a príprava konštruktu pre expresiu v rastlinách
(B) Transformácia pletív tabaku pomocou agrobaktérií
(C) Proteínové extrakty transgénnych rastlín tabaku testované na schopnosť inhibovať rast fytopatogénnych húb

Špecifickú formu biotického stresu pre rastliny predstavujú aj parazitické rastliny. Parazitické rastliny rodov Phelipanche, Orobanche a Striga spp. (čeľaď Orobanchaceae, zárazovité) patria do skupiny ekonomicky významných parazitických burín s negatívnym vplyvom na produkciu a výnosy poľnohospodárskych plodín. Parazitické rastliny týchto rodov po vyklíčení napoja svoj koreňový systém na korene hostiteľských rastlín a z nich čerpajú vodu a potrebné živiny. V súčasnosti neexistuje účinná metóda eliminácie týchto burín, preto sa celosvetový výskum zameriava na získanie poznatkov o génoch a mechanizmoch, ktoré sa podieľajú na interakcii medzi týmito parazitickými rastlinami a hostiteľskými rastlinami. Jedným z kľúčových mechanizmov je rozpoznanie prítomnosti vhodnej hostiteľskej rastliny v pôde. Vzťah medzi hostiteľskými rastlinami (hostiteľ) a parazitickými rastlinami (parazit) je vysoko špecifický. Hostiteľ vylučuje do rizosféry látky, ktoré sú rozpoznávané parazitom a na základe ich prítomnosti semená parazitických rastlín začnú klíčiť. Rozpoznanie týchto látok zaručuje, že začnú klíčiť iba v blízkosti hostiteľa. Najvýznamnejšou skupinou látok indukujúcich klíčenie sú novoobjavené rastlinné hormóny - strigolaktóny. V našom výskume sa zameriavame na objasnenie biosyntézy, detekcie a funkcií strigolaktónov v rastlinách a ich úlohy v komunikácii s parazitickými rastlinami a inými mikroorganizmami.

tl_files/images/Obr3_JL kopie.jpg
Pelipanche ramosa čerpá živiny a vodu z koreňov rajčiaka (Lycopersicon esculentum)

V rámci druhej oblasti zahrňujúcej optimalizáciu expresie transgénov v rastlinách sa zameriavame na izoláciu pletivovo-špecifických promótorov z rastlinného zdroja(ov) s osekvenovaným genómom (Arabidopsis thaliana L.) a testujeme ich schopnosť zachovať si špecifický charakter v transgénnom organizme. Ukazuje sa, že CaMV35S promótor, ktorý sa vo väčšine prípadov využíva na riadenie expresie selekčného génu má schopnosť zmeniť pletivovo-špecifický profil niektorých typov promótorov na konštitutívny, ak sa vyskytujú  vo vzájomnenej blízkosti. Promótory, ktoré sú na takýto vplyv rezistentné, majú prednostné využitie v rastlinných biotechnológiách predovšetkým vtedy, ak je nevyhnutné zachovať pletivovo/vývinovo špecifický charakter transgénu.

tl_files/images/Obr4_JL.JPG
Ukážka zachovania špecifického expresného profilu jedného z testovaných promótorov v peli a embryu transgénneho organizmu tabaku

Transgénne rastliny majú v súčasnosti veľa zástancov ale i odporcov. Jedným z argumentov ich oponentov je otázka miery rizika pre človeka a životné prostredie. Cieľom nášho výskumu je testovať stratégie, ktoré bio-bezpečnosť transgénnych rastlín zvyšujú. Jeden z promótorov, ktorý sme izolovali, bol úspešne využitý pri príprave bio-bezpečných transgénnych rastlín, u ktorých sme sledovali špecifický zostrih selekčného markerového (SM) génu kódujúceho rezistenciu ku antibiotikám v peli a embryu, ak svoju úlohu daný gén pri selekcii transgénnych rastlín od netransgénnych už splnil. Potomstvo takýchto rastlín obsahovalo už len cielený gén. Jedna z technológií, ktorou je možné bio-bezpečné transgénne rastliny pripraviť sa nazýva Cre/loxP. Použitý promótor, ktorý riadi zostrih loxP kazety prostredníctvom Cre rekombinázy sa javí kľúčovým prvkom z hľadiska efektívnosti systému.
tl_files/images/Obr5 SK_JL_oprava.jpg

(A) Schéma zostrihu selekčného markerového (SM) génu v transgénnych rastlinách transformovaných vektorovým konštruktom so samozostrihujúcou sa Cre/loxP kazetou
(B) Funkčnosť zostrihu SM génu bola testovaná na tabaku - modelovej rastline pre transformáciu